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 技术原理

  CRISPR/Cas9Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)是最新出现的一种由sgRNA指导Cas核酸酶对靶向基因进行特定DNA修饰的技术。在这一系统中,sgRNA引导序列靶定位点剪切双链DNA达到对基因组DNA 进行修饰的目的。CRISPR/Cas9系统能够对小鼠和大鼠基因组特定基因位点进行精确编辑,目前华夏凯奇已经成功将此技术应用于大、小鼠基因KO/KI的模型制备,以及条件性敲除(Loxp系统)模型的制备。
   
   目前华夏凯奇采取优化过的野生型Cas9双切口Cas9nOptimized Cas9 System,OCAS and OCASn)。采用优化过的双切口Cas9n(OCASn)可以将脱靶效应降到最低。
 
 
常规基因敲入
 
    利用CRISPR/Cas9基因敲入技术,针对靶基因设计、构建相应的gRNA质粒和donor质粒,通过Cas9核酸酶的切割作用和同源臂的同源重组,引入特定的突变、报告基因(如EGFP、mCherry、RFP、LacZ等)需要表达的功能性cDNA(如cre、Dre等)到目的基因的特定位点。

研发周期

4-6个月

 

运用

  • 适用于cre工具小鼠模型的建立,与条件性基因敲除小鼠进行交配用于研究目的基因在特定组织或细胞中的功能等;
  • 适用于携带报告基因和标签的小鼠模型的建立,用于研究目的基因在特定组织中的定位或表达等
  • 适用于人源化基因工程小鼠模型的建立,模拟人类致病机制,用于疾病治疗的药物研发和药效评价;
 

 

 

条件性基因敲入

    利用CRISPR/Cas9基因敲入技术,针对靶基因设计、构建相应的gRNA质粒和donor质粒,将外源基因或特定突变敲入引入到基因组目的基因的特定位点。

 
 
研发周期
 4-6个月
 
 运用
  • 通过控制cre重组酶的时空特异性表达从而特异性地启动敲入目的基因的表达;
 
Rosa26位点定点敲入
   根据Rosa26基因序列设计合成sgRNA,构建含同源序列和目的序列的片段与Cas9、sgRNA共同显微注射入受精卵中,Cas9/sgRNA复合体与基因组靶序列结合并切割双链DNA,以含目的片段的同源序列为模版修复基因组DNA,最终获得在Rosa26基因intron中定点插入片段的小鼠。

 

 

 

H11位点定点过表达

   H11位点(也叫Hipp11)位于小鼠第11号染色体,是 Eif4enif1与Drg1 这两个基因之间的一个位点,由于H11位点位于两个基因之间,外源基因插入后內源基因表达的影响很小同时H11位点所在的Eif4enif1与Drg1这两个基因的侧翼序列区域具有广泛的空间和时间EST表达模式,能够使整合在此的外源基因受指定启动子的驱动而稳定表达。该位点的纯合敲入小鼠可正常发育和繁殖。
 
    利用CRISPR/cas9系统可以在H11位点构建条件性基因过表达小鼠模型,广泛型强启动子pCAG与外源目的基因cDNA之间用loxP-stop-loxP结构隔开,只有与组织特异性Cre工具鼠交配后,才会在特异细胞或组织中表达目的基因。

 

 

研发周期

4-7个月

 

技术优势

  • 按设计精准插入;
  • 基本保证过表达;
  • 遗传稳定性高;
  • 无需筛选,直接用于分析。
 

 

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